百迪超級(jí)NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)試劑套裝（6L）Kit
- 品名： 百迪超級(jí)NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)試劑套裝（6L）Kit
- 型號(hào)： S1045-KIT
- 產(chǎn)品詳情
- 規(guī)格參數(shù)
產(chǎn)品信息
| 適用范圍 | 試劑 |
|---|---|
| 使用方法 | 一、試劑配制 1. 培養(yǎng)瓶包被液：18ml PBS加入本試劑盒1支試劑Ⅰ、1支試劑Ⅱ。 2. 增殖培養(yǎng)基：每1000ml免疫細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中加入本試劑盒1支試劑Ⅴ。 3. 活化培養(yǎng)基的配制：配制完增殖培養(yǎng)基后，取出500ml增殖培養(yǎng)基，加入本試劑盒1支試 劑Ⅳ、1支活化培養(yǎng)基添加物。 二、取材 取材時(shí)使用一次性負(fù)壓采血管抽取自體外周血 50ml。（建議使用枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑） 或臨床獲得健康新生兒臍帶血。（建議使用枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑）。 三、NK細(xì)胞的培養(yǎng) 1. 培養(yǎng)前：T175 培養(yǎng)瓶中加入包被液，2-8℃冰箱過(guò)夜，或置于 37℃培養(yǎng)箱中至少包被 2h。 2. 第0天：取出2支高效離心管，分別加入15ml樣本密度分離液，200g離心1min，確保離 心后隔片下充滿分離液，隔片上有0.5-1cm高度分離液。小心將25ml抗凝血緩慢沿管壁 加至分離液界面上，確保血液及分離液之間有明顯界面（每管可加15-25ml血液，若超過(guò) 25ml，則分管）。600g，離心30min（也可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)），注意慢升慢降。 3. 離心后可觀察從上至下分為4層，淡黃色血漿層，白色環(huán)狀PBMC層，分離液層，紅細(xì)胞 層。用吸管吸取血漿層，做滅活處理。 滅活步驟：置于水浴鍋中56℃，30min；然后-20℃靜置10min；最后800g，離心 15min，保留上清棄去沉淀，短期保存于4℃?zhèn)溆?，長(zhǎng)期保存請(qǐng)置于-20℃~-80℃環(huán)境下。 4. 用吸管吸取 PBMC 細(xì)胞層至 50ml 離心管中，為盡量獲得更多細(xì)胞，建議隔片以上部分 全部吸取，注意不要吸到紅細(xì)胞。在 PBMC 離心管中加入 PBS 混勻（PBS 量要多于吸取 的 PBMC 體積），600g，離心 10min。棄去上清，加入 PBS 復(fù)溶洗滌，300g，離心 10min。 5. 分離出的 PBMC 用未加任何因子的免疫細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基配制成細(xì)胞懸液 40ml，加入 1 整套試劑Ⅲ（5 支全部加入），加入 1 支試劑Ⅸ。將上述所有液體加入到棄掉包被液的培 養(yǎng)瓶中，加入 8ml 自體血漿，置于飽和濕度、37℃、5.0% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（注：建 議接種密度為 1-3×106 個(gè)/ml，如分離后細(xì)胞數(shù)少，則相對(duì)應(yīng)減少培養(yǎng)基及血漿使用量， 但是活化因子添加量不變。） 注意：先使用完所有活化培養(yǎng)基，再使用增殖培養(yǎng)基。由于個(gè)體差異問(wèn)題，每個(gè)樣本生長(zhǎng) 速度不一致，添加培養(yǎng)基的時(shí)間不一定要嚴(yán)格按照以下時(shí)間進(jìn)行，需根據(jù)具體情況具體分 析， 確保細(xì)胞已經(jīng)活化成功，呈現(xiàn)聚團(tuán)生長(zhǎng)的情況，細(xì)胞數(shù)量有增殖。在補(bǔ)加培養(yǎng)基后， 細(xì)胞密 度維持在 1×106 個(gè)/ml，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。 6. 第 3 天加入 40ml NK 活化培養(yǎng)基，加入 5ml 血漿，加入 1 支試劑Ⅸ，1 支試劑Ⅵ。 7. 第5天加入70ml NK活化培養(yǎng)基，加入5ml血漿，加入1支試劑Ⅸ，1支試劑Ⅶ。 8. 第7天將培養(yǎng)瓶中細(xì)胞完全吹打下來(lái)，輕輕搖勻瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，無(wú)菌取出0.5ml-1ml細(xì)胞液 計(jì)數(shù)，視細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞密度，建議加入剩余自體血漿并補(bǔ)加剩余的活化培養(yǎng)基。轉(zhuǎn) 移到1個(gè)培養(yǎng)袋。 9. 第9天：輕輕搖勻袋內(nèi)培養(yǎng)液，無(wú)菌取出0.5ml-1ml細(xì)胞液計(jì)數(shù)，視細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞 密度，建議培養(yǎng)袋補(bǔ)加增殖培養(yǎng)基500ml。 10.第11-12天輕輕搖勻袋內(nèi)培養(yǎng)液，無(wú)菌取出0.5ml-1ml細(xì)胞液計(jì)數(shù)，視細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì) 胞密度，建議培養(yǎng)袋補(bǔ)加增殖培養(yǎng)基1000ml 。（細(xì)胞總量達(dá)到20億時(shí)進(jìn)行此項(xiàng)操作） 11.第13-15天輕輕搖勻袋內(nèi)培養(yǎng)液，無(wú)菌取出0.5ml-1ml細(xì)胞液計(jì)數(shù)，細(xì)胞總量達(dá)到30億時(shí)， 建議培養(yǎng)袋補(bǔ)加增殖培養(yǎng)基1000ml。此時(shí)取樣做細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測(cè)。 12.第15-18天輕輕搖勻袋內(nèi)培養(yǎng)液，無(wú)菌取出0.5ml-1ml 細(xì)胞液計(jì)數(shù)，細(xì)胞總量達(dá)到60 億 時(shí)，將1500ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的3L培養(yǎng)袋中，建議每個(gè)培養(yǎng)袋補(bǔ)加增殖培養(yǎng)基1500 ml。此時(shí)取樣做細(xì)菌、真菌、支原體、內(nèi)毒素檢測(cè)。 13.第18-21天，收集NK細(xì)胞懸液6000ml，1500rpm×5min離心后棄去上清液，250ml離 心管集2管每管生理鹽水200ml洗滌（ 1500rpm×8min ）1次 ，再用50ml離心管生理 鹽水 100ml洗滌（1200rpm×5min ）1次，按照100ml生理鹽水+ 8ml 20%人血清白 蛋白重懸細(xì)胞，封裝好后備用，同時(shí)留樣封存以備日后檢測(cè)。 注：分批收獲細(xì)胞：擴(kuò)袋培養(yǎng)時(shí)，可收獲一部分的細(xì)胞，剩余的部分繼續(xù)補(bǔ)加增殖培養(yǎng)基 進(jìn)行擴(kuò)增（原則為按照細(xì)胞密度補(bǔ)液），客戶可按照方案分批收集或一次性收集。 |
| 注意事項(xiàng) | 1. 使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀本試劑盒說(shuō)明書，并嚴(yán)格按照說(shuō)明書執(zhí)行操作。 2. 本試劑盒必須按規(guī)定溫度保存，不可反復(fù)凍融。試劑在使用前需解凍，并充分混勻，不 可劇烈震蕩。 3. 可視細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)際狀況適當(dāng)調(diào)整補(bǔ)液時(shí)間和用量。 |
| 聲明 | 僅用于科研使用，不能用于臨床診斷和治療。 |
| 保存條件 | 根據(jù)說(shuō)明書內(nèi)容，有效期12個(gè)月。 |
暫無(wú)內(nèi)容...
